35年狼疮性肾炎临床与基础研究

摘要　本研究在国内首次发现异常增高的循环白介素-6可导致狼疮性全身性病理损害；白介素-6异常增高在狼疮性小管间质损害过程中可能具有重要作用；白介素-6及其信息传递中的GP130,JunB基因异常表达参与了弥漫性增生性狼疮性肾炎(LN)分子发病过程，并率先发现丹参通过增强c-myc蛋白高水平表达而诱导细胞凋亡，从而对人肾成纤维细胞增殖产生抑制作用。在国内外首次证实巨噬细胞在LN的病人肾脏局部增殖，且和疾病严重程度呈正相关。首次发现白介素受体(sIL-2R)和FLCT增多是诊断早期活动LN的可靠指标。筛选并建立了一种本病活动性的计分方法；发现小管间质病变分级对LN肾小球病理、临床表现、治疗、疗效及复发的判断均有指导意义。在国内首先报道超大剂激素冲击疗法治疗严重的活动性LN，率先提出适合我国国情的改进CTX冲击疗法治疗LN。发现中药在促进骨髓造血，对抗CTX等致免疫功能过度抑制具有一定作用。首次在国内探讨了LN尿毒症的可逆性，并分析发现SLE死亡最主要原因并非尿毒症。

　　狼疮性肾炎(LN)是一种临床常见的自身免疫性疾病，严重影响着人民的健康。由于其诊断治疗较为棘手，发病机制仍不明确，因此LN的研究一直受到国内外学者的重视［1～9］，我们课题组对此病作了30多年的临床和实验研究，于1963年在国内最早分析了当时国内最大组别的系统性红斑狼疮(SLE)［10］，以后不断地进行临床观察和研究。近年来随着细胞分子生物学技术的发展，我们对其分子发病机理与临床进行了综合研究，现总结如下。

1　发病机理

1.1　白细胞介素-6
　　白细胞介素-6(白介素-6)与LN发病机理仍然尚不十分清楚，为了确定LN病人体内是否存在内源性白介素-6表达增高及其来源，我们应用ELISA法检测58例LN病人的血清及外周血单个核细胞(PBMC)内白介素-6蛋白的水平［11］，在国内首次采用原位杂交方法结合IBAS 2.0图像分析系统，检测其中20例LN病人PBMC在未受任何刺激时白介素-6 mRNA表达强度，并分析3者之间的关系。结果表明该3者水平在LN病人体内均异常增高，活动期尤其明显，3者之间互呈直线正相关。提示LN病人PBMC内源性过度表达和合成白介素-6是其外周白介素-6水平增高的原因之一，异常增高的循环白介素-6对狼疮性全身性病理损害，尤其对肾损害具有重要的作用，同时证明血清白介素-6增高可提示LN处于活动期，对临床指导治疗有一定意义。另外，我们探讨了白介素-6在狼疮性小管间质病变中的作用［12］，通过检测42例活动期LN患者尿白介素-6水平与其中的15例肾小管间质白介素-6 mRNA水平，发现42例活动期LN患者中有36例尿白介素-6肌酐比值＞5 ng/mg，其增高程度与尿微球蛋白(β2-MG)及NAG酶活性水平呈显著正相关；在15例肾组织切片中，肾小管间质均有白介素-6 mRNA表达，小管间质病变愈严重，其表达量愈高，而健康肾组织小管间质几乎无白介素-6 mRNA表达。提示LN患者活动期尿白介素-6水平异常增高与肾小管间质白介素-6 mRNA异常表达有关，白介素-6在狼疮性小管间质损害过程中可能具有重要作用。
　　 有关白介素-6信号传递系统中GP130和JunB是否参与了弥漫性增生性LN的分子病理过程目前国内外尚无报道。我们采用原位杂交技术观察了20例弥漫性增生性LN患者肾活检组织肾小球细胞中白介素-6、GP130和JunB mRNA表达，并分析其与患者肾小球系膜区增宽和尿蛋白之间的关系［13］，结果在国内外首次发现弥漫性增生性LN患者白介素-6、GP130 JunB基因mRNA表达分别是6.6±0.9，8.6±0.9和6.7±0.8，较对照组明显增加(P＜0.01)；白介素-6、GP130 mRNA表达与系膜区增宽和尿蛋白排泄量呈正相关。提示白介素-6及其信息传递中的GP130和JunB基因异常表达在弥漫性增生性分子发病机理中起一定作用，为LN的分子病理机制提供了新的实验依据。

1.2　细胞凋亡
　　近年来，细胞凋亡理论的引入为LN发病机制的研究开拓了一个新的领域。LN与细胞凋亡之间具有密切的相关性［14］。我们率先在国内成功分离培养LN患者肾活检组织的成纤维细胞，探索环磷酰胺能否通过诱导细胞凋亡来减轻纤维化病变，观察环磷酰胺衍生物4-氢过氧环磷酰胺(4-hydroperoxycyclophosphamide,4-HC)对LN患者肾间质成纤维细胞凋亡的影响［15］，结果发现4-HC可明显促进其凋亡，这为临床应用环磷酰胺治疗LN、减轻肾间质纤维化和延缓肾功能恶化，提供新的实验证据。另外检测了丹参(ρ=10 g/L或20 g/L)对人肾成纤维细胞氚标记胸苷(3H-TdR)掺入率的影响，并用流式细胞仪检测细胞的程序性死亡(programmed cell death)即凋亡(apoptosis)［16］，结果显示：丹参对人肾成纤维细胞增殖有抑制作用，且呈剂量依赖性。流式细胞仪检测程序性细胞死亡结果表明，丹参可促使人肾成纤维细胞发生程序性死亡，呈剂量依赖性。丹参通过使c-myc蛋白高水平表达而诱导细胞凋亡，从而对人肾成纤维细胞增殖有抑制作用。

1.3　巨噬细胞
　巨噬细胞的局部增殖在LN发病机制中的作用尚无人报道［17］。在LN性肾炎的肾病理组织切片中发现许多巨噬细胞，传统观点认为肾脏中的巨噬细胞来源于血液的单核细胞，这些巨噬细胞在肾组织中不再增殖。我们的研究在世界上首先发现巨噬细胞在LN病人肾脏局部增殖，其增殖程度和疾病严重程度呈正相关，例如在Ⅳ型LN，增殖的巨噬细胞明显多于Ⅱ型LN［18，19］。提示巨噬细胞局部增殖在LN的致病中起重要的作用，同时也为寻找新的治疗手段提供了新线索。由于巨噬细胞局部增殖使炎症反应放大，如能抑制巨噬细胞的局部增殖，使能有效地抑制疾病的进展［20］。

2　临床研究

2.1　临床表现与病理
　　临床上我们对LN特点进行了全面和系统的临床观察，包括对老年LN［21］、儿童LN［22］和SLE临床免疫学特征［23］进行了研究。发现LN仍以女性为主，但临床免疫学特征也有差异。通过对66例男性和463例女性患者临床特点的比较，发现男女之比为1∶7，男性出现肾损害的间隔时间短于女性(P＜0.05)，以肾损害为首发症状者较女性多见(P＜0.05)；男性脾肿大、盘状红斑等症状高于女性(P＜0.05)，但关节痛、蝶形红斑等低于女性(P＜0.05)；男性死亡率Ⅴ型LN发病率高于女性［24］。另外对152例LN的呼吸系统临床表现［25］、系统性红斑狼疮(SLE)肺胸膜病变［26］和LN并肾性尿崩症［27］也进行了观察研究。对SLE患者心脏病变也进行了研究［28］，结果发现有超声心动图异常的79例(61.24%)，其中瓣膜异常52例，心包积液36例，心肌异常24例，兼有不同程度的瓣膜、心肌或心包病变者34例，有抗磷脂抗体的患者心瓣膜损害的发病率较高(67.3%)，提示这种抗体在SLE患者心瓣膜病变的发病机制中可能有促进作用。我们曾报道了SLE的临床免疫学特征，例如抗Rib-P是诊断SLE的重要指标，但我们首次发现抗Rib-P阳性和阴性组肾损害无明显的差别，它与SLE神经系统损害和关节炎等关系密切［29］，通过对130例与160例LN免疫血清指标进行观察［30］，结果进一步证实：①抗Sm抗体与疾病活跃程度相关，可作为判断病情、监测疗效的血清学指标；②抗Sm抗体阳性常伴内脏病变、皮肤损害严重，易脱发；③抗Sm抗体为标记性抗体，对SLE诊断特异性很高，此与国内外报道相似。我们也报告了经肾活检诊断的75例LN，分析了其临床、实验室和病理检查资料［31］，结果病理类型以弥漫增生型最多，活动性指数的病理积分也以该型最高，此与国内外的认识一致。另外对系统性红斑狼疮的误诊进行了分析［32］，这些观察极大地丰富了LN肾外临床表现的研究内容，补充了SLE的临床研究的某些空白点。

2.2　活动指标
　　LN活动指征的判定对诊治本病具有非常重要的意义。为了寻找更加准确合理地评估SLE(LN)活动的客观指征，我们在国内首次对30例LN患者尿中内白介素-2受体(IL-2R)和免疫球蛋白自由轻链(FLCT)进行了观察，结果发现sIL-2R和FLCT增多是诊断活动LN早期可靠指标［33～35］，研究了尿白介素-6检测在SLE病情判断中的价值［36］，结果发现各型LN患者尿白介素-6水平均明显升高，其中隐匿型尿白介素-6水平已有明显升高，肾功能不全型尿白介素-6水平显著高于隐匿型、肾炎型或肾病综合征型。活动期LN患者尿白介素-6水平显著高于非活动期，经治疗后明显降低，复发时重新升高。WHO Ⅳ型LN患者尿白介素-6水平明显高于其他病理类型。此外，尿白介素-6水平与血清白介素-6水平不相关，但与抗dsDNA抗体相关。因此提示尿白介素-6检测可作为LN早期诊断、活动性监测、疗效及复发判断的非创伤性生化指标之一，并可部分替代肾活检。另外我们观察了LN活动期和环磷酰胺(CTX)加激素冲击治疗后8周患者晨尿白介素-8水平的变化［37］，以治疗稳定期的LN患者作对照，发现LN活动期患者尿白介素-8水平显著高于稳定期LN患者；CTX加激素治疗8周后的白介素-8水平显著低于治疗前，狼疮活动的临床症状和生化指标明显好转，提示尿白介素-8水平与LN的病变活动密切相关，并可作为LN活动和预后评估的一个重要参数。在国内首次以临床医师的判断作为疾病活动程度的外部标准，对117例LN患者的资料进行单因素相关分析和多元回归分析，筛选出了与LN疾病活动程度相关性最好的临床与实验室指标，并建立了一种疾病活动性的计分方法［38］。结果筛选出14个最能提示疾病活动性的参数，并以各参数在多元回归分析中的回归系数作为其各自的加权分(略加简化)，建立的这种LN疾病活动程度的计分方法，即活动性指数，它能较简便、合理、有效地测定LN的活动程度。我们也探讨了经肾活检的75例LN，并分析了其临床、实验室和病理检查资料［39］。全部病例的肾活检结果均有肾脏的免疫病理学及组织病理学异常。病理类型以弥漫增生型最多，活动性指数的病理积分也以该型最高。LN的临床表现、实验室检查与病理类型有一定的相关性，通过观察不同病理类型LN的肾损害表现及实验室特点，提出了根据LN临床表现和实验室检查结果，可以大致推测其病理类型，估计肾损害的严重程度，以指导治疗，判断预后。对LN患者肾小管间质病变(TIL)病理分级与临床的关系也进行了研究［40］，发现活动性LN中TIL发生率高，小管功