冷冻保存同种异体血管研究进展

1　血管移植免疫进展

　　大量的实验和临床结果不但证实血管内皮细胞(EC)是移植排斥重要的靶器官，而且通过其抗 原递呈作用、表型变化和细胞因子合成等，主动参与移植排斥过程。EC表达多种抗原，如： ABO血型抗原，MHC抗原和血管内皮细胞抗原系统。在排斥过程中，EC上的抗原与其相应的抗 体结合形成抗原抗体复合物，激活补体释放趋化因子，白细胞在补体参与下溶解EC，使基底 膜暴露，激活凝血系统，形成血栓，激活的巨噬细胞释放白介素-1、肿瘤坏死因子等可提 高EC表面组织因子活动，增加纤溶酶激活物抑制因子和减少血栓调理蛋白，EC在细胞因子刺 激下可合成和分泌单核细胞趋化因子MCP-1/JE，吸引单核巨噬细胞迁移至移植物局部。同 时表达Class Ⅱ抗原，提供所有激活CD4+ T细胞所必需的信号，并可产生各种细胞因子， 引 起表型的变化。另外内皮细胞膜还可作为血管紧张素转化酶场所，以使血管紧张素Ⅰ转化成 血管紧张素Ⅱ，使血管收缩。近来，一些学者发现血管平滑肌细胞也表达Class Ⅰ和Class Ⅱ抗原系统，参与排斥反应全过程〔1〕。

2　同种异体血管移植的基础研究进展

2.1　移植前血管处理及冷冻复温技术

2.1.1　制备　(1)供体选择来源于新鲜尸体及创伤性截肢患者，采用美国组织库协会(AATB) 制 定的标准〔2〕。取血管应在死后4 h完成，所有操作均在无菌条件下进行。(2)制备 技术的基本原则：从供体获取血管应严格遵循无创伤技术；获取血管前15～30 min，供体给 予平滑肌松弛剂(罂粟碱)及抗凝药物(肝素)，以防止血管痉挛和血栓形成；保持制备液和室 温37℃；灌注压＜100 mg。(3)理论上以37℃自身含罂粟碱肝素化血液低压灌注可最好保持 血管的生物活性，但通常从供体获取血液是困难的。目前常采用37℃的生物培养液(如DMEM ，1640)，Brocdbank等获得保存24 h后80%内皮细胞存活率和平滑肌收缩度最大限度的保持 〔3〕。
2.1.2　冷冻复温　随着冷冻保护剂二甲基亚砜(DMSO)和甘油的应用及控温冷冻技术的成熟 ，血管活性得以很好的保持。DMSO因穿透力强，研究较多，其浓度以15%为最佳。控温冷冻 第二步温值在-60～-80℃之间，冷冻速率为0.5～1℃/min，复温采用37℃水浴快速复温。经 过这样处理的静脉获得80%的内皮细胞存活率。Banbang等证实这些内皮细胞具有与正常内皮 细胞相似的增值和抗凝血功能〔4〕。Salomon等也从冷冻保存静脉上获得表达HLA抗 原的平滑肌细胞〔1〕。

2.2　实验性同种异体移植与自体移植的比较性研究　同种异体血管移植的 主要障碍是受体 的免疫排斥反应。因此，研究在免疫缺陷的情况下在体冷冻保存血管移植的变化是必需的。 这样自体冷冻血管不仅检验血管制备及宿主对移植物产生排斥反应的冷冻保存技术的效果， 而且通过与同种异体移植物移植后组织结构与功能的对比，了解同种异体移植物在整个过程 中的变化。
　　自体移植物在移植过程中，可因离体缺血、牵拉、切割、吻合及在受体动脉高压冲 击下，内皮细胞可有不同程度的坏死，从而使位于内皮细胞下的结缔组织裸露于血流，使附 壁血栓形成。1周后残留的附壁血栓向致密而平滑的纤维被膜演变，同时内皮细胞再生开始 。内膜增生和动脉粥样硬化是发生在内皮下层两个相关联的病理现象，或许是不可避免的创 伤适应性改变。移植血管中膜可见平滑肌细胞坏死和纤维替代，外膜因部分胶原纤维束断裂 和血管滋养管栓塞，形成纤维瘢痕，移植后72 h，新的滋养血管出现，2个月后基本恢复正 常，神经再生于2～4周后开始。上述这些改变实质上是导致自体静脉移植后失败的病理基础 。
　　相对于自体静脉移植的内膜增生，同种异体移植物动脉化主要是中膜增生〔5〕 。当在同种异体移植物中又观察到的内膜增生是由于局部血栓沉积后成纤维细胞的重新排 列，移植后10 d内皮细胞因免疫反应而脱落，在随后的6个月内，裸露的内膜上纤维蛋白 堆积减少并出现重新内皮化，3～6个月移植物外膜的血管周围组织可见游离淋巴细胞并在9 个月后消失。移植后5个月前列环素(PGI2)生成量与受体动脉PGI2生成量相比有显著性 差异(P＜0.001)〔6〕。新鲜静脉的顺应性明显低于正常动脉灌注压下动脉顺应 性(P＜0.001)〔5〕，可以看出，尽管移植段静脉结构发生动脉化，但其内 膜 功能和生物力学特性并未发生动脉化。自体移植物与异体移植物短期的不同在于异体移植物 经历一个免疫反应及内皮细胞脱落的过程，因此，减少或阻止受体免疫排斥反应的实验被 尝试。

2.3　免疫抑制剂对同种异体移植物的影响　移植物免疫反应特点已见前述 ，可以肯定免疫 排斥反应在移植过程中扮演极其重要的角色。Augelli分别用倒置异体静脉作为动脉桥接物 ，结果显示经免疫抑制剂处理组与未用免疫抑制剂处理组通畅率之比为7/11∶0/10，有显著 性差异(P＜0.001)，但长期通畅率依赖于免疫抑制剂的应用〔7〕。Miller等移 植术后受体行免疫抑制治疗及抗血小板治疗1月后，血管平滑肌丧失功能〔8〕。可以看出尽管免疫抑制剂可能增加移植物通畅率，并且不损害内皮细胞的可能性也存在，但免疫抑制剂增加血小板聚集及血栓素(TxA2)的释放，减少前列环素(PGI2)的产生，同时潜在的免疫抑制特性可能导致感染、神经、肾毒、肝脏、血液、内分泌等并发症〔9〕。因此，移植物的治疗代替受体的治疗能避免免疫抑制剂的并发症，这建立在冷冻保存移植物免疫抑制剂术前治疗可能会减低免疫反应和提高通畅率这个假设上，静脉移植物术前治疗能显著提高通畅率已作为一种方法被肯定。

2.4　血管移植受体的抗凝血治疗　在药物实验中抗血小板治疗能减少移植物血栓形成的观点已被接受。动物实验证明，经抗血小板治疗的异体移植物与未经治疗移植物早期通畅率之比为83%∶58%〔10〕。近年来，对阿司匹林等抗凝药物的作用机制有新的看法，认为其在抑制血小板释放效应的同时，也抑制血管内皮细胞PGI2的合成〔11〕。因此，抗凝药物使用与否，有待于进一步的对比研究和临床长期观察。

3　临床应用的初步结果

　　初期一些学者通过戊二醛、酒精浸泡、冷冻、射线照射等来降低移植物的抗原性，以提高移植物的通畅率，这些研究结果从术后6～12个月15%至13～42个月78%的不等通畅率。1971年D用改良的脐带静脉行下肢血管重建术后3年获得76.4%(股)～39.8%(股腓)的通畅率。Shan等列出了38个患者43条硫酸软骨素保存的静脉得到9～17个月至12～18个月累积67.8%的通畅率。1994年Mestres报道用大口径冷冻保存动脉得到8个月92.9%的通畅率〔12〕。另外，一些回顾性的随机的临床报告正着手调查，这些研究包括失败的机制以及猜测治疗干涉手段或改善移植术的外科技术，更多的临床经验和移植物的长期观察和积累，将决定是否在无合适的自体血管下有限制的使用问题。

4　同种异体血管移植失败的影响因素
　　影响移植段通畅率的因素，分为内源性和外源性两类，影响移植段远期通畅率的主要因素是内源性因素。外源性因素包括：(1)手术技术缺陷：未遵循无创伤原则，吻合技术所致吻合口狭窄、扭曲等；(2)流出道受阻：Mcnally报道在膝关节以下动脉旁路移植术后1年通畅率的结果，当移植物处于0～1个流出道情况下得到44%的通畅率，而在2～3个流出道时则获得73%的通畅率〔13〕；(3)静脉移植瓣膜；(4)其他：如内毒素、感染等。内源性因素包括：(1)免疫排斥反应；(2)管壁结构的病理性改变，如动脉粥样硬化；(3)生物力学的不匹配，如顺应性的改变；(4)移植段功能的改变，如PGI2的释放减少，TxA2的释放增加。另外，血管内膜释放的内皮细胞血管舒张因子(EDRF)、内皮素(ET)、抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)和肝素分子复合物、血栓调理蛋白(TM)、蛋白激酶C(PC)以及纤溶酶原激活物(PA)也参与整个过程〔14〕。近来一些生长因子，如血小板衍生因子、碱性成纤维细胞生长因子和转移生长因子的作用也得到重视〔15〕。这些物质如何相互作用，影响移植物通畅率，是今后值得进一步研究的课题。

5　展望

　　尽管冷冻小血管异体移植已经取得很大成绩，并展示出令人激动的前景，但仍有许多尚未解决的问题和难点，如移植段新生内皮细胞的来源，冷冻保存能否降低抗原性，冷冻保存动脉移植能否成为合适的移植物应用于临床。大部分血管移植的最终目的是保存完整肢体的成活，特别在创伤外科中，当合并有其他严重创伤不能耐受手术时，如果肢体能被冷冻保存直至能耐受手术时再植，肢体就能挽救。依靠现代冷冻保存技术，肢体延迟重建将由梦想变为现实。而改进HLA配型技术、提供体质量、新的免疫抑制剂和生物制品的开发和应用以及移植后准确灵敏的免疫检测等，仍是移植免疫学研究的重要课题。